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【微球流式】曾俊翔:仪器平台的开发
2024-01-28 12:48  浏览:23


【微球流式】

包括所有利用微球——不管是否有磁性,去捕捉溶液中的待测分子,利用流式原理进行检测——微球流动起来,目前看一定是荧光的技术。

TA有很多别的名称,如:流式荧光、液相芯片、悬浮阵列、多功能流式点阵、多重微珠流式免疫荧光、流式点阵免疫发光、流式荧光发光、免疫荧光发光等。


荧光:特征光谱和识别

荧光化合物吸收一定波长的光能,外层电子从基态跃迁到激发态,受激电子很快返回基态,释放出一定波长的发射光,称之为荧光。

每种荧光化合物都有特定的吸收光谱和发射光谱。“谱”意味着有范围,有峰有谷。

流式仪器主要通过滤光片来分光,可以将不同波长的光信号引导到不同的探测器,就形成了对应的荧光通道。
  • 长通滤光片(LP):允许特定波长以上的光通过,如LP735滤光片允许735nm以上的光通过
  • 短通滤光片(SP):允许特定波长以下的光通过,如SP472滤光片允许472nm以下的光通过
  • 带通滤光片(BP):只有特定波长范围内的光可以通过滤光片,如BP572/30滤光片允许557nm-587nm(572±15)波长的光通过

图片来自ThermoFisher网站
荧光通道的信号是特定激发下的某一波长范围内的光信号,并不等于特定荧光素的光信号,只有在理想情况下,荧光通道的信号就是对应荧光素的光信号。以市面上最常用的报告荧光SAPE为例,在下图中可以看到FITC荧光素的发射光有部分进入到了PE检测通道中,那么PE通道的信号值(流式的试剂检测值)其实等于PE荧光素的光信号还要加上FITC荧光素溢漏到PE通道中的光信号,如果我们想要知道的是PE荧光素的光信号,那这个时候就要扣除掉FITC荧光素溢漏到过PE通道的光信号。


微球流式:编码荧光和报告荧光
在微球流式中,编码荧光用于微球的编码和区分,报告荧光用于指示标志物浓度。
编码荧光

编码方式有多荧光编码和单荧光编码,后者为了实现更多重编码,往往采用不同粒径的微球,结合前散光信号进行识别。

  • 使用最为广泛的编码荧光染料为APC和APC-Cy7,均采用红激光激发。发射光谱见下图,APC和APC-Cy7的最大发射波长是660nm767nm

图片来自ThermoFisher荧光光谱查看器(SpectraViewer)
  • 鼻祖公司Luminex的荧光编码没有公布具体染料,100重微球采用两个红光激发的荧光染料,其最大发射波长为658nm712nm。500重微球则采用三个红光激发的荧光染料。

  • 有的公司采用蓝激光激发染料,特别是采用量子点染料,如中翰盛泰、东方生物等。量子点荧光信号很集中,波长范围较窄。
报告荧光

PE是目前微球流式中使用最广泛的报告荧光,使用方式有两种:SAPE和生物素标记抗体联用体系,PE直接标记抗体体系,前者通常会多一步孵育反应,后者的标记工艺则较为复杂。

PE可以用蓝激光或绿激光激发。

图片来自ThermoFisher荧光光谱查看器(SpectraViewer)

也有公司采用APC做标记荧光,当然此时APC和APC-Cy7不是编码荧光。

应当避免编码荧光和报告荧光的相互干扰,如Luminex使用532nm激光器激发PE作为报告荧光,使用635nm激光器激发编码荧光,可以使报告荧光和编码荧光互不影响。
若方案中无法避免,也可考虑从仪器的软件上进行处理:
  • 编码荧光会溢漏到报告荧光通道中,因为编码微球的荧光量是固定的,可以不处理或通过扣除每种编码微球对应的本底方式来调节;
  • 报告荧光会溢漏到编码荧光通道中,因为报告荧光会随检测而波动,应采取补偿的方式,或选取间隔足够远的编码微球,来保证编码微球能够在不同浓度的待测物检测时都能被正确识别;
  • 编码荧光之间存在互相影响,可进行补偿调节或不处理,应注意在微球制备检验和试剂盒检测时采用同样的处理方式,选择正确识别的编码微球。

上图为典型的流式荧光模式:APCAPC-Cy7双荧光编码+PE报告荧光在蓝、红激光对应三荧光检测通道下的检测示意图。在考虑其他的方案时可使用赛默飞的荧光光谱查看器(SpectraViewer)之类的工具进行初步分析。

流式荧光开发平台的设想

细胞流式/微球流式兼容机

一台机器兼容细胞流式和微球流式。常规的2激光6色流式细胞仪可以检测APC/APC-Cy体系编码微球。Luminex编码微球第二波长相对特殊,需要定制荧光通道或升级到红激光三通道的流式细胞仪。这类机器可以支持不同粒径微球的识别。仪器需另外设计自动化的识别和分析软件。

半自动或批式机

通常激光器和检测通道固定,采用APC/APC-Cy7体系或Luminex体系,有的兼容两家体系,还可定制修改,但无传统的细胞流式功能。

Luminex的仪器由于控制软件的圈门固定,仅能识别特定荧光特定编码强度的微球,仅可使用编码荧光种类和编码强度都和Luminex系列保持一致的编码微球。仪器通过软件的限制需使用特定的微球,开发需要授权。

连续进样全自动平台

如同生化免疫分析仪,单管处理,连续进样。要进入传统诊断市场,这是唯一的选择。

流式荧光平台的开展主要考虑编码微球和仪器能否互相适配,如果从零开始,建议选择APCAPC-Cy7双荧光编码微球去搭配合适的仪器,在微球和仪器上的选择都有足够的余地;如果已有独特的编码微球和报告荧光选择,建议先使用流式细胞仪进行方案的验证后再选择流式细胞仪/流式点阵仪厂家进行定制化的检测器设计或自行开发。


图片来自微信公众号《中国诗词大会》。《武林旧事》所载“百味馄饨”,十种颜色(由植物染料熬制而成),十种馅料,组成百种口味。

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