作者：方振峰，杨园，房辉，杨光（江汉大学 医学院药学系，湖北 武汉 430056）
摘 要
目 的 筛选滇南美登木中总三萜最优提取工艺。方 法 以齐墩果酸为对照品，滇南美登木中总三萜含量为指标，用5%香草醛-冰醋酸、高氯酸显色，采用紫外分光光度法考察了提取方法、提取时间、料液比、提取次数、超声功率等五种因素对滇南美登木总三萜提取的影响，并对最佳提取工艺进行验证。结 果 滇南美登木总三萜提取最佳工艺条件为超声法提取，时间60 min，料液比（g/mL）为1∶20，提取1次，超声功率设定为450 W，所得总三萜含量为23.99 mg/g。结 论 最优提取工艺条件操作简单、易行，为进一步研究滇南美登木化学成分和药理活性提供了一定的实验依据。
关键词
滇南美登木；总三萜类；提取工艺；紫外分光光度法
0 引言
美登木属植物全世界约有300种，主要产于热带及亚热带地区，以南美洲分布最多。中国约有20种和1个变种，主要分布在云南省、长江以南各省区，西藏自治区也有分布，多生长于山谷山坡或水边的树林中［1］。自从美国科学家从齿叶美登木（Maytenusserrata）中分离得到高等植物中第一个大环内酯类天然抗肿瘤活性成分［2］，美登木属植物受到了人们的广泛关注。国内学者陆续对云南美登木［3-8］、密花美登木［9-12］、刺茶美登木［13］、广西美登木［14］、海南美登木［15-16］、厚叶 美登木［17］、滇南美登木［18-19］等多种美登木属植物及其代谢产物的化学成分和药理活性进行研究。但美登木属植物中生物碱类成分含量较低，三萜类成分是其主要化学成分。三萜类化合物表现出较强的抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性［8］。
滇南美登木（Maytenus austroyunnanensis S. J. Pei et Y. H. Li）为卫矛科（Celastraceae）美登木属（Maytenus Molina）植物，主要产于云南的景洪、勐养、勐罕、双江、思茅、耿马等地［20］。文献调研发现，目前对该种植物的研究较少，三萜类成分为其主要化学成分，约有14种，其中部分化合物表现出良好的抗肿瘤活性［18-19］。为了更好地开发利用该种植物，笔者对滇南美登木中总三萜的提取工艺进行了研究，以齐墩果酸为标准品，总三萜类含量为指标，5%香草醛-冰醋酸、高氯酸为显色剂，采用紫外分光光度法分别考察了提取方法、提取时间、料液比、提取次数、超声功率 5 种因素对滇南美登木总三萜类成分提取的影响，筛选出最优提取工艺，以期对滇南美登木化学成分及药理活性的深入研究提供一定的实验依据。
1 材料
1.1 仪器设备
ME104E电子天平，精度：0.000 1 g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；岛津AUX120D 分析天平（精度：0.01 mg，岛津国际贸易上海有限公司）；UVmini—1240紫外可见分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司））；超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；真空旋转蒸发器（上海 申生科技有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（上海秋佐科学仪器有限公司）；ST—510Y 1 000 g高速摇摆粉碎机（浙江瑞安市塞特机电有限公司）。
1.2 试剂
甲醇、冰醋酸、高氯酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；齐墩果酸分析对照品（北京索莱宝科技有限公司，批号308D027，CAS：508-01-01，HPLC ≥ 98.0%）。
1.3 药材
滇南美登木药材产自云南省西双版纳，经江汉大学医学院药学系张涛教授鉴定为卫矛科美登木属植物滇南美登木Maytenus austroyunnanensis S.J.Pei et Y.H.Li的茎和叶。
2 方法和结果
2.1 含量测定
2.1.1 溶液的制备 1）对照品溶液的制备
精密称取7.96 mg齐墩果酸对照品，置于10mL容量瓶中，加适量的甲醇，超声溶解，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度为0.7960mg/mL对照品溶液。
2）供试品溶液的制备
取干燥后的滇南美登木药材，粉碎，过60目筛，精密称取1.5g粉末，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇30mL，超声提取1h，过滤，回收溶剂，浸膏用适量甲醇溶解并转移到25mL容量瓶中，甲醇定容到刻度，过滤，续滤液即为供试品溶液。
3）显色溶液的制备
精密量取齐墩果酸对照品溶液、供试品溶液和蒸馏水各0.1mL，分别置于10mL容量瓶中， 分别加入0.3%香草醛-冰醋酸溶液0.3mL，摇匀，再加入高氯酸溶液1mL，摇匀，置于60℃水浴中加热25min，冷却，再加入冰醋酸1mL，摇匀，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品显色溶液、供试品显色溶液和空白对照显色溶液。
2.1.2 最大吸收波长的测定 取适量“2.1.1”项下对照品显色溶液和供试品显色溶液，照紫外可见分光光度法，在200~ 800nm扫描，结果二者在553nm处均有最大吸收，故选553nm为测定波长。
2.1.3 标准曲线的绘制 分别精密量取上述齐墩果酸对照品溶液0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0. 30、0. 35 mL，按“2.1.1”项“显色溶液的制备”同法操作。以空白显色溶液为参比，在553 nm处测定吸光度，以齐墩果酸浓度（C，mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程A=0.016 5 C+ 0.179 1（r = 0.999 9）。表明齐墩果酸在3.98 ~ 27.86 mg/mL范围内呈良好的线性关系。
2.1.4 检测限和定量限 将空白显色溶液连续测定6次，进行时间扫描，记录吸光度，得到平均
吸光度值，即噪音。取对照品溶液按“2.1.1溶液的制备”项下“显色溶液的制备”同法操作，稀释成不同浓度进行吸光度测定，扣除空白，所得吸光度值为噪音值3倍时的浓度为检测限，得到检测限为3.98mg/L。所得吸光度值为噪音值10倍时的浓度为定量限，得到检测限为12.56mg/L。
2.1.5 精密度试验 日内精密度试验：精密吸取对照品溶液0.5mL，置于100mL容量瓶中，按
“2.1.1 溶液的制备”项下“显色溶液的制备”同法操作，在最大吸收波长处测定6次，记录吸光度。结果齐墩果酸吸光度的RSD为0.67%(n= 6)，表明仪器的日内精密度良好。
日间精密度试验：取对照品溶液0.5mL，按“2.1.1溶液的制备”项下“显色溶液的制备”同法
操作，在最大吸收波长处测定，连续3d，每天2次，记录吸光度。结果齐墩果酸吸光度的RSD为
1. 88%（n = 6），表明仪器的日间精密度良好。
2.1.6 重复性试验 称取同一批滇南美登木药材粉末6份，每份约1.5g，精密称定，按“2.1.1溶
液的制备”项下“供试品溶液的制备”和“显色溶液的制备”同法操作，在最大吸收波长处测定，记
录吸光度。结果总三萜吸光度的RSD为1.04%，表明方法重现性良好。
2.1.7 稳定性试验 取滇南美登木药材粉末1.5g，精密称定，按“2.1.1溶液的制备”项下“供试品溶液的制备”和“显色溶液的制备”同法操作，于0、0.5、1、2、6、12、24 h在最大吸收波长处测定，记录吸光度。测得吸光度RSD为1.49%，结果表明供试品溶液在24h内基本稳定。
2.1.8 加样回收试验 取样品药材粉末约0.5 g，共9份，精密称定，分别按样品含量的80%、
100% 和120%加入标准品，按“2.1.1溶液的制备”项下“供试品溶液的制备”和“显色溶液的制
备”同法操作，在最大吸收波长处测定，记录吸光度，计算平均加样回收率及RSD，结果见表1。
2.2 单因素实验
2.2.1 提取方法考察 取滇南美登木药材粉末2份，每份1.5g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶
中，加入甲醇45mL，分别采用超声和加热回流两种方法提取40min，过滤，回收溶剂，浸膏用适量甲醇溶解并转移到25mL容量瓶中，甲醇定容，过滤，取续滤液0.1mL，按“2.1.1”项下“显色溶液
的制备”同法操作。在最大吸收波长553nm处测定吸光度，计算样品中总三萜含量。每种方法平行测定3次。实验结果表明，超声提取时总三萜含量为（22.37±0.27）mg/g，而加热回流
法提取时总三萜含量为（16.84±1.43）mg/g。利用SPSS22.0软件进行ANOVA单因素分析，
表明超声提取所得总三萜含量和加热回流提取所得总三萜含量在统计学上存在非常显著性差异
（P=0.003<0.01），可能由于超声波可产生强烈的空化、机械粉碎以及热作用，使三萜物质更好溶于溶剂中，并且超声提取法经济成本更低、操作更加方便，因此，本实验提取方法采取超声提取。
2.2.2料液比的考察取滇南美登木药材粉末5份，每份约1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入甲醇溶液，甲醇体积按料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50计算，分别按“2.1.1”
项下“供试品溶液的制备”和“显色溶液的制备”同法操作，在最大吸收波长553nm处测定吸光度，计算样品中总三萜含量。平行测定3次，结果见表2。同时，在测得三萜含量的数值满足方差齐性的前提条件（P>0.05）下，进行了料液比对滇南美登木总三萜含量影响的ANOVA单因素两两间多重比较LSD检验，结果见表3。
从表2中可以看出，滇南美登木总三萜含量先随着料液比的增大而增大，当料液比为1∶30时，总三萜成分含量最高为（22.54±0.54）mg/g；1∶20时，次之，为（21.96±0.57）mg/g，可能是因为随着料液比增大，溶剂与药材接触能更充分，使更多的有效成分溶解出来。但当料液比达到1∶40时，其含量骤然下降，随后变化不大。另外，从表3中可知，料液比1∶20、1∶30时所得含量
与1∶10、1∶40、1∶50时所得含量之间分别存在非常显著性或极其显著性差异，但1∶10、1∶40、
1∶50时所得含量之间以及1∶20、1∶30时所得含量之间进行两两比较时均无明显统计学上差异。因此，综合含量以及成本考虑，选取料液比1∶20为滇南美登木总三萜提取时最佳料液比。
2.2.3提取时间的考察称取滇南美登木药材粉末5份，每份约1.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液30mL，分别超声提取30、60、90、120min，按“2.1.1”项下“供试品溶液的制备”和“显色溶剂的制备”同法操作，在最大吸收波长553nm处测定吸光度，计算样品中总三萜含量。平行测定3次，结果见表4。同时，在测得的三萜含量的数值满足方差齐性的前提条件（P>
0.05）下，进行了提取时间对总三萜含量影响的ANOVA单因素两两间多重比较LSD检验，结果见表5。
从表4中可以看出，滇南美登木总三萜含量在提取时间为60min时最高，为（22.72±
0.68）mg/g，随后随着时间的增加，含量有所下降，可能是因为随着时间增加，发生了副反应导致总三萜得率下降。另外，从表5中可知，提取时间为60min时所得三萜含量与其他提取时间所得三萜含量之间进行两两比较时，在统计学上存在显著、非常显著或极其显著性的差异。因此，选取提取时间60min为滇南美登木总三萜提取时最佳提取时间。
2.2.4提取次数的考察称取滇南美登木药材粉末3份，每份约1.5g，精密称定，置于具塞锥形
瓶中，加入甲醇溶液30mL，超声提取60min，分别超声提取1、2、3次，按“2.1.1”项下“供试品溶
液的制备”和“显色溶剂的制备”同法操作，在最大吸收波长553nm处测定吸光度，计算样品中总三萜含量。平行测定3次，结果见表6。同时，在测得的三萜含量的数值满足方差齐性的前提条件（P>0.05）下，进行了提取次数对总三萜含量影响的ANOVA单因素两两间多重比较LSD检
验，结果见表7。
从表6中可以看出，滇南美登木总三萜含量在提取次数为1时最高，为（22.90±0.58）mg/g，
随后总三萜得率下降。从表7中可知，提取1次、2次和3次时所得三萜含量之间进行ANOVA单因素LSD多重比较时，在统计学上表现出无明显差异（P>0.05）。因此，从节约时间以及溶剂成本方面考虑，选取提取次数为1次作为滇南美登木总三萜提取时最佳提取次数。
2.2.5超声功率的考察取滇南美登木药材粉末5份，每份1.5g，精密称定，并置于具塞锥形瓶
中，分别设定超声功率为300、350、400、450、500W，按“2.1.1”项下“供试品溶液的制备”和“显色
溶剂的制备”同法操作，在最大吸收波长553nm处测定吸光度，计算样品中总三萜含量。平行测定3次，结果见表8。同时，在测得的三萜含量的数值满足方差齐性的前提条件（P>0.05）下，
进行了超声功率对总三萜含量影响的ANOVA单因素两两间多重比较LSD检验，结果见表9。
从表8中可以看出，在超声功率为450W时提取滇南美登木总三萜含量最高，为（23.27± 0.66）mg/g。同时，从表9中可知，在超声功率为450W时所得三萜含量与其他4种功率提取所得总三萜的含量在统计学上存在显著性差异（P<0.05）或非常显著性差异（P<0.01），而超声功率为300、350、400以及500W时提取滇南美登木总三萜含量之间在统计学上无明显差异（P>0.05）。因此，选取超声功率为450W作为提取滇南美登木总三萜时最佳超声功率。
2.3 验证试验
取滇南美登木药材粉末3份，每份1.5g，精密称取，在最优提取工艺条件下，按“2.1.1溶液的制备”项下“供试品溶液的制备”和“显色溶液的制备”同法操作，在最大吸收波长553nm处测定吸光度，计算滇南美登木中总三萜含量。结果滇南美登木中总三萜平均含量为23.99mg/g（n= 3，RSD = 0.69%），表明该提取工艺合理。
3 结论
美登木属植物具有良好的抗肿瘤活性，其中滇南美登木为我国特有物种，其主要成分三萜类具有良好的抗肿瘤活性，但文献调研发现，目前人们对其研究较少。本实验建立了滇南美登木中总三萜类含量的测定方法，并通过单因素实验考察了提取方法、提取时间、料液比、提取次数、超声功率5种因素对总三萜含量的影响，利用SPSS22.0软件对单因素实验数据进行ANOVA单因素统计分析和两两间多重比较LSD检验，筛选出最优滇南美登木总三萜的提取工艺条件：超声提取，料液比（g/mL）为1∶20，超声功率为450 W，提取1次，时间为60 min，所得到滇南美登木三萜含量最高，为23.99 mg/g。该方法提取率高、操作简单、方法可靠、实验数据准确，为滇南美登木化学成分及药理活性的深入研究提供一定的实验依据。
参考文献略
文献来源：方振峰，杨园，房辉，杨光. 滇南美登木总三萜提取工艺研究[J]. 江汉大学学报（自然科学版）, 2022, 50(5): 90-96.
基金项目：江汉大学校级科研项目（2021yb132）
DOI：10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2022.05.012
