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发酵工艺:红霉素的发酵(种子培养、培养基、补料以及菌体浓度对发酵的影响)
2023-08-31 12:44  浏览:25

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1. 种子培养

生产孢子的制备:红色糖多胞菌斜面孢子培养基由淀粉、玉米浆、硫酸铵等组成,孢子培养的温度为37℃,湿度50﹪左右。母瓶斜面培养9d,子瓶斜面培养7d。成熟的孢子呈深米黄色,色泽鲜艳、均匀、无黑点,孢子瓶背面有红色色素。

生产种子的制备:种子罐及繁殖罐的培养基由淀粉、葡萄糖、花生饼粉、蛋白胨、硫酸铵和碳酸钙等组成,灭菌后将子瓶斜面孢子制成孢子悬液,用微控注射的方式接 入种子罐。种子培养温度为35℃,培养时间为65h,繁殖罐培养温度为33℃,培养时间为3032h左右。种子培养成熟并经检验合格后以10﹪的接种量移入发酵罐。

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培养基

发酵培养基最适合的碳源为蔗糖、其次为葡萄糖、淀粉、糊精。生产上常用葡萄糖和淀粉为混合碳源,效果与使用葡萄糖相似。

氮源的代谢对红霉素合成影响很大,当适于菌体生长的氮源耗尽时,菌体才停止生长并迅速合成红霉素。红霉素生产中一般都用有机氮源,其中以黄豆饼粉、玉米浆为最佳。由于黄豆饼粉菌时泡沫较多,故一、二级种子罐及后期补料用部分花生饼粉代替,但全用花生饼粉则最终产品会出现带会现象。在发酵培养基中加少量硫酸铵,可促进菌丝生长。    

丙酸是红霉内脂(合成红霉素的三中产物之一)合成的前体物质,但丙酸对菌丝生长有抑制作用,所以发酵时以丙醇为发酵前体物质,丙醇在发酵时对菌丝的毒性作用相对较小,对pH的影响也较小,代谢稳定,发酵单位和产品质量都较高。此外,正丙醇除了起前体作用外,还对红色糖多孢菌中乙酰CoA合成的诱导物。

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培养条件 

温度:红霉素发酵采用31℃恒温培养。温度过高时,会产生红霉素C,红霉素C与红霉素A结构相似,但毒性却是红霉素A的两倍
pH:整个发酵过程中pH维持在6.67.2,菌丝生长良好,发酵水平稳定。红色糖多孢菌最适生长pH6.77.0,而红霉素合成的最适 pH6.7 6.9
通气和搅拌:红霉素发酵为好氧发酵。一般地,发酵最初12h,通气量保持在0.4vvm(每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值),12h后到放罐可控制在0.81.0vvm。搅拌速度不宜太快,容易损伤菌丝,不利于发酵。

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补料

发酵过程中还原糖浓度控制在1.0%~1.4%范围内,每隔6补加葡萄糖一次,直到放罐前1218停止补糖。40后补加有机氮源,每日34次,若发酵罐的黏度上升则增加补料量,反之则减少,放罐前24停止补氮。发酵后期添加氨水可以提高发酵单位,减少脱水红霉素的形成,改善产品质量,补加硫酸镁可以改善菌丝生长状况,提高发酵单位。

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菌体浓度对发酵的影响及控制

发酵接种量较大且保持在合适的浓度,则缩短细菌生长期,使产物合成时间提前;但是如果接种量过大,超出适宜值,则生长过快,物料黏度增加,导致溶氧不足,最终影响产物合成。 

5.1 碳源对发酵的影响及其控制

按菌体利用快慢而言,分为迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源。前者(如葡萄糖)能较迅速地参与代谢、合成菌体和产生能量,并产生分解代谢产物,因此有利于菌体生长,但有的分解代谢产物对产物的合成可能产生阻遏作用;后者(如乳糖)为菌体缓慢利用,有利于延长代谢产物的合成,特别有利于延长抗生素的生产期,也为许多微生物药物的发酵所采用。

5.2 氮源对发酵的影响及其控制 

氮源有无机氮源和有机氮源两类。如谷氨酸发酵,当NH4+供应不足时,就促使形成α-酮戊二酸;过量的NH4+,反而促使谷氨酸转变成谷氨酰胺。发酵培养基一般是选用含有快速利用和慢速利用的混合氮源。如氨基酸发酵用铵盐(硫酸铵或醋酸铵)和麸皮水解液、玉米浆。

补加有机氮源:根据产生菌的代谢情况,可在发酵过程中添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源,如酵母粉、玉米浆、尿素等。

补加无机氮源:补加氨水或硫酸铵是工业上的常用方法。氨水既可作为无机氮源,又可调节pH值。在抗生素发酵工业中,通氨是提高发酵产量的有效措施。当pH值偏高而又需补氮时,就可补加生理酸性物质的硫酸铵,以达到提高氮含量和调节pH值的双重目的。

5.3磷酸盐对发酵的影响及其控制

磷是微生物菌体生长繁殖所必需的成分,也是合成代谢产物所必需的,磷酸盐浓度的控制,对于初级代谢来说,要求不如次级代谢那么严格。对抗生素发酵来说,常常是采用生长亚适量(对菌体生长不是最适合但又不影响生长的量)的磷酸盐浓度,其最适浓度取决于菌种特性、培养条件、培养基组成和来源等因素。

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